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Análisis celular dendrítico integral por citometría de flujo a través del uso del nuevo panel CompDC™

Author: David Draper, PhD | Associate Director, Scientific Development
Date: February 2019


To address the growing need for robust comprehensive DC immunophenotyping in murine pre-clinical models, we have configured a new standard panel, CompDC™. En este artículo destacado sobre tecnología demostraremos cómo se puede usar este panel para analizar diversos subgrupos de CD en muestras de células tumorales y derivadas de otros tejidos.

Las respuestas antitumorales mediadas por células T dependen de la actividad de la células presentadoras de antígenos (CPA) que presentan el antígeno asociado al tumor (AAT) y envían señales coestimuladoras a las células T. Esto a su vez activa las células T específicas del tumor, desencadenando su expansión y reclutamiento al tumor donde ejercen sus efectos. Las células dendríticas (CD) son CPA profesionales que son fundamentales en este proceso. Las CD se pueden activar para expresar numerosos ligandos de moléculas coestimuladoras y pueden internalizar el antígeno y presentar péptidos inmunodominantes tanto a las células T CD4+ como a las CD8+. El desarrollo de nuevas terapias que aprovechan la función de las CD es un área de investigación intensiva. To facilitate these efforts and address the growing need for robust comprehensive DC immunophenotyping in murine pre-clinical models, we have configured a new standard panel, CompDC™. En este artículo destacado sobre tecnología demostraremos cómo se puede usar este panel para analizar diversos subgrupos de CD en muestras de células tumorales y derivadas de otros tejidos.

For a general introduction to the different DC subsets and their function in cancer biology, read our blog “An Introduction to Dendritic Cell Biology and Analysis Using Syngeneic Immuno-Oncology Models” 

Con el panel CompDC™ los investigadores pueden determinar si la terapia in vivo afecta la abundancia y el estado de activación de diferentes subgrupos de CD en el tumor, ganglios linfáticos (GL) que drenan el tumor u otros compartimentos huésped. Se trata de un panel de 12 colores que combina un conjunto de anticuerpos que, cuando se lo examina adecuadamente, delinea los distintos subgrupos de CD y deja ver el potencial de activación de células T de las CD (cuadro 1). Mediante una meticulosa estrategia de gating, el panel primero facilita el análisis de CD con precisión al excluir macrófagos, granulocitos y células B usando un gate (portal) de exclusión. Este proceso minimiza el riesgo de que el análisis de CD se vea comprometido por la contaminación con células irrelevantes o autofluorescentes. Luego se usa la expresión de CD24 para delinear los subgrupos de CD convencionales, que generalmente se clasifican por niveles de expresión medios a altos de CD11c y CMH clase II. Estas CD convencionales incluyen el subgrupo DC1 CD103+/CD8+ y el subgrupo DC2 CD11b+ (imagen 1A), que según lo demostrado generan respuestas antitumorales de las células T CD8+ y CD4+ respectivamente.[1] La expresión de XCR1 se ha documentado en varios grupos como un marcador para CD con actividad de presentación cruzada, un fenotipo requerido para la activación de células T CD8+ mediada por CD.[2] Las imágenes 1B y 1C demuestran el análisis de CD XCR1+ en células derivadas del tumor B16-F10 y ganglios linfáticos de drenaje. La expresión de XCR1 suele estar asociada al subrupo DC1, tal como se muestra. Por último, se mide la expresión de marcadores de maduración CD80 y CD86 para evaluar el potencial coestimulador de células T de las CD. La imagen 1D muestra que la expresión de estos marcadores es relativamente baja en CD en tumores de melanoma B16-F10, un indicio de la imunosupresión impartida en las CD por el microambiente tumoral (MAT).

Cuadro 1: Anticuerpos del panel CompDC™ y descripción de su utilidad

Anticuerpo/tinte Descripción  
CD45 Marcador de células inmunitarias pan  

F4/80, Ly-6G, CD19

Gate de exclusión para macrófagos, granulocitos y células B  
CD11c Marcador de células dendríticas  
CD24 Marcador de células dendríticas  
CD8 Marcador de DC1  
CMH clase II Marcador de células dendríticas/marcador de maduración  
CD103 Marcador de DC1  
CD11b Marcador de DC2  
XCR1 Marcador de células dendríticas migratorias/de presentación cruzada  
CD80 Marcador de maduración  
CD86 Marcador de maduración  
Tinte de viabilidad Exclusión de células muertas  
El panel CompDC™ se puede personalizar para analizar subgrupos de CD inflamatorias (CDinf) y CD plasmacitoides sustituyendo los anticuerpos Ly-6C/CD206 y Siglec-H respectivamente.  
Figura 1: análisis de subgrupos de CD usando el panel CompDC™. Se recolectaron tumores tipo melanoma B16-F10 de ratones. Análisis de subgrupo de DC1 y DC2 en células derivadas de tumores (A), expresión de XCR1 en células DC1 CD103+ en el tumor (B) y ganglios linfáticos (GL) de ratones con tumores B16-F10 (C). Expresión de marcadores coestimuladores CD80 y CD86 en el total CD derivadas de tumores (D). El pico rojo representa las células con tinción objetivo. El pico azul representa el control negativo sin tinción.

Figura 1: análisis de subgrupos de CD usando el panel CompDC™. Se recolectaron tumores tipo melanoma B16-F10 de ratones. Análisis de subgrupo de DC1 y DC2 en células derivadas de tumores (A), expresión de XCR1 en células DC1 CD103+ en el tumor (B) y ganglios linfáticos (GL) de ratones con tumores B16-F10 (C). Expresión de marcadores coestimuladores CD80 y CD86 en el total CD derivadas de tumores (D). El pico rojo representa las células con tinción objetivo. El pico azul representa el control negativo sin tinción.
 

El panel CompDC™ también se puede personalizar para analizar dos subgrupos de CD adicionales. Esto incluye CD inflamatorias (CDinf) y el análisis se realiza sustituyendo los anticuerpos anti-CD206 y anti-Ly-6C. Se ha demostrado que las CDinf promueven actividad antitumoral y se pueden delinear fuera del gate de células supresoras derivadas de mieloides monocíticas (CSDM-M) como células CD11c+MHCII+CD11b+CD206+ (imagen 2A).[3] También se pueden cuantificar las CD plasmocitoides (CDp) al sustituir un anticuerpo anti-Siglec-H. Si bien la función de las CDp en el MAT no se ha caracterizado por completo, muchos informes indican que estas CDp pueden tener una función reducida e incluso un efecto inmunosupresor en las respuestas antitumorales.[4] Las CDp suelen tener bajos niveles de expresión de CD11c y son positivas apra Siglec-H, como se muestra en la imagen 2B.

Figura 2: análisis de subgrupos CDInf y CDp mediante la personalización del panel CompDC™. (A) Análisis de CDInf en células derivadas del tumor B16-F10. (B) Análisis de CDp en células derivadas de carcinoma colorrectal CT26.

Figura 2: análisis de subgrupos CDInf y CDp mediante la personalización del panel CompDC™. (A) Análisis de CDInf en células derivadas del tumor B16-F10. (B) Análisis de CDp en células derivadas de carcinoma colorrectal CT26.

To learn more about the CompDC™ panel and how to incorporate it into your research, contact the scientists at Labcorp.


Referencias


1Gardner, A., & Ruffell, B. (2016). Dendritic cells and cancer immunity. Trends in immunology, 37(12), 855-865.

2Wylie, B., Seppanen, E., Xiao, K., Zemek, R., Zanker, D., Prato, S., … & Waithman, J. (2015). Cross-presentation of cutaneous melanoma antigen by migratory XCR1+ CD103− and XCR1+ CD103+ dendritic cells. Oncoimmunology4(8), e1019198.

3Kuhn, S., Yang, J., & Ronchese, F. (2015). Monocyte-derived dendritic cells are essential for CD8+ T cell activation and antitumor responses after local immunotherapy. Frontiers in immunology6, 584. 

4Mitchell, D., Chintala, S., & Dey, M. (2018). Plasmacytoid dendritic cell in immunity and cancer. Journal of neuroimmunology.

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