Transportadores e interacciones entre fármacos

Métodos para interacciones entre transportadores

• Ensayo de transportadores para la absorción

  • Sistema de prueba: líneas celulares transfectadas que expresan un solo transportador para absorción (SLC) o control de vectores, cultivadas en monocapas en una incubadora humidificada a 37 °C en CO₂ al 5%.
  • Buffer de ensayo: HBSS con HEPES, pH 7,4
  • Solo para transportadores MATE, las células se tratan previamente con NH₄Cl para introducir un gradiente de pH en toda la membrana celular, necesario para la actividad de absorción de MATE
  • Concentraciones del artículo de prueba: 2 para ensayos con sustratos, 2 para ensayos de inhibición
  • Sustratos de prueba marcados radioactivamente específicos para cada transportador
  • Inhibidores de control positivo para cada transportador

  Las células que expresan transportadores en cultivo se incuban previamente con un buffer de ensayo por 30 minutos en una incubadora humidificada a 37°C en CO₂ al 5%. Las células que expresan MATE se tratan con NH4CI para crear un gradiente de pH en toda la membrana celular con el objetivo de facilitar la actividad de absorción. Se agrega un sustrato de prueba o artículo de prueba a los pocillos triplicados y se agregan inhibidores según corresponda. Las placas se incuban por un intervalo de tiempo de 2 a 10 minutos según el transportador. Se aspira el buffer y las células se lavan y luego se lisan, recogen y analizan para detectar la presencia del artículo de prueba mediante LC-MS. 

  Evaluación de sustratos: se comparará la absorción del artículo de prueba por cada transportador individualmente o en presencia de inhibidores selectivos con la absorción por el control de vectores después de la incubación durante 2 a 5 minutos. Se efectuará la absorción de un sustrato de prueba por cada transportador individualmente o en presencia de un inhibidor selectivo y por el control de vectores a modo de controles. 

  Evaluación de inhibidores: se efectuará la absorción de un sustrato de prueba por cada transportador individualmente o en presencia de un inhibidor selectivo o el artículo de prueba. También se efectuará la absorción del sustrato de prueba por el control de vectores a modo de control. Si se observa la inhibición, se puede determinar la IC₅₀.

• Ensayo de transportadores para el eflujo

  • Sistema de prueba: células endoteliales de intestino humano Caco-2, cultivadas en placas Transwell en una incubadora humidificada a 37 °C en CO₂ al 5% por entre 21 y 24 días
  • Buffer de ensayo: HBSS con HEPES, pH 7,4 en las cámaras apicales y basolaterales
  • Se mide la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) antes del ensayo para confirmar la formación de uniones estrechas
  • Concentraciones del artículo de prueba: 2 para ensayos con sustratos, 2 para ensayos de inhibición
  • Se usan los marcadores de permeabilidad manitol y cafeína marcados radioactivamente para verificar la formación de uniones estrechas
  • Se usan sustratos de prueba específicos para cada transportador marcados radioactivamente
  • Inhibidores selectivos de control positivo para cada transportador con controles de inhibidores negativos

  Se determina la permeabilidad aparente del artículo de prueba y el sustrato de prueba en dirección apical a basolateral (A-B) y basolateral a apical (B-A) en placas Transwell. Después de 30 minutos de incubación previa en un buffer de ensayo en una incubadora humidificada a 37 °C en CO₂ al 5%, el sustrato o artículo de prueba se agrega a una cámara (donante) con un buffer vacío en la cámara opuesta (receptor). Luego, se agregan los inhibidores a ambas cámaras según corresponda. Se incuban las placas a 37° C en CO₂ al 5% por 2 horas. Se recogen las muestras de las cámaras donantes y receptoras y se analizan para detectar la presencia del artículo de prueba mediante LC-MS. Se determina la relación de permeabilidad y eflujo del artículo de prueba.

  Evaluación de sustratos: se determinará el transporte del artículo de prueba individualmente o en presencia de inhibidores selectivos en ambas direcciones. Se efectuará el transporte de un sustrato de prueba para cada transportador individualmente o en presencia de inhibidores selectivos a modo de controles. 

  Evaluación de inhibidores: se determinará el transporte de un sustrato de prueba en ambas direcciones después de la incubación durante 2 horas individualmente o en presencia de inhibidores selectivos o el artículo de prueba. Si se observa la inhibición del transporte para el eflujo, se puede determinar la IC₅₀.

• Ensayo de absorción de membrana vesicular

  • Sistema de prueba: vesículas de membrana (50 µg/pocillo) que expresan el transportador para eflujo (ABC) BSEP.
  • Concentraciones del artículo de prueba: 2 para ensayos con sustratos; 2 para ensayos de inhibición.
  • Se mide la actividad dependiente de adenosín trifosfato (ATP), con adenosín monofosfato (AMP) como control.
  • Sustrato de prueba específico para BSEP marcado radioactivamente
  • Inhibidores de control positivo para cada transportador

  Las vesículas de membrana que expresan BSEP y el artículo de prueba o el sustrato de prueba se incubarán en placas de 96 pocillos. Se iniciará la absorción mediante la incorporación de adenosín trifosfato (ATP), seguida de la incubación por 30 minutos a 37 °C. Se usará adenosín monofosfato (AMP) en paralelo como control negativo. Se concluirá la absorción mediante la aspiración y el enjuague de los filtros dos veces con el excedente de buffer de transporte helado. Luego, se extraen las vesículas de las placas de filtro para la cuantificación por LC-MS y el cálculo de la actividad dependiente de ATP.

  Evaluación de sustratos: se comparará la absorción del artículo de prueba individualmente y con inhibidores selectivos en presencia de ATP con la absorción en presencia de AMP. Se efectuará la absorción del sustrato de prueba por BSEP individualmente y en presencia de inhibidores selectivos a modo de controles.

  Evaluación de inhibidores: se efectuará la absorción de un sustrato de prueba individualmente y en presencia de inhibidores selectivos o el artículo de prueba; se comparará la absorción en presencia de ATP con la absorción en presencia de AMP. Si se observa la inhibición de la absorción dependiente de ATP del artículo de prueba, se puede determinar la IC₅₀.