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OECD 229: Programa de Evaluación de Disruptores Endocrinos - Ensayo reproductivo a corto plazo en peces

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Los disruptores endocrinos sustancias o mezclas exógenas que alteran la(s) función(es) del sistema endocrino y, en consecuencia, causan efectos adversos para la salud en un organismo intacto, o su progenie, o (sub)poblaciones.

AUTOR:

Sarah Broadley, BSc (Hons), MSc, PGCE, Científica de Investigación IV, Servicios de Patología Especializada; Dra. Catherine Ross, DVM, MSc, MRCVS, Patóloga, Departamento de Patología de Covance Laboratories Ltd., Harrogate, RU

FECHA:

Enero de 2021

Introducción

"Los disruptores endocrinos son sustancias o mezclas exógenas que alteran la(s) función(es) del sistema endocrino y, en consecuencia, causan efectos adversos para la salud en un organismo intacto, o su progenie, o (sub)poblaciones". CISP-OMS, 2002.

El Programa de Evaluación de Disruptores Endocrinos (EDSP) se desarrolló para determinar si un pesticida, producto químico u otra sustancia puede suponer un riesgo para la salud humana o el medioambiente por alguna disrupción en el sistema endocrino. El ensayo de reproducción a corto plazo (pauta de prueba 229) se valida usando la carpita cabezona (Pimephales promelas) y con un subconjunto de parámetros sobre el medaka japonés o pez cebra. El ensayo considera la idoneidad reproductiva como una medición integrada de efectos venenosos usando una variedad de parámetros histológicos y bioquímicos que reflejan efectos asociados a una alteración del eje endocrino hipotalámico-hipofisario-gonadal (HHG).

Reglamentaciones

En 2018, la OCDE publicó un marco conceptual revisado de pautas para hacer pruebas y evaluar la disrupción endocrina de químicos. El marco conceptual está integrado por cinco niveles de pruebas y está diseñado para usarse como conjunto de herramientas.

Nivel 1: ordenar y priorizar basado en la información existente.

Nivel 2: ensayos in vitro para generar datos mecanísticos.

Nivel 3: ensayos in vivo para generar datos sobre los mecanismos endocrinos seleccionados y efectos.

Nivel 4: ensayos in vivo para generar datos sobre efectos adversos en mecanismos endocrinos.

Nivel 5: ensayos in vivo para generar datos integrales sobre efectos de los mecanismos endocrinos y otros mecanismos.

El ensayo de reproducción a corto plazo en peces entra en el Nivel 3 junto con el ensayo de metamorfosis en anfibios, el ensayo uterotrópico y el ensayo de Hershberger.

Actualmente, en la UE no existe ningún requisito reglamentario de usar pruebas específicas para disrupción endocrina a menos que se solicite hacerlas.

En EE. UU., no obstante, las pruebas son obligatorias y la EPA de EE. UU. ha desarrollado una estrategia de dos niveles.

Ensayos de nivel 1: una selección de ensayos in vitro e in vivo. El ensayo de reproducción a corto plazo en peces y el ensayo de metamorfosis en anfibios entran dentro de esta variedad de pruebas.

Ensayos de nivel 2: ensayos atípicos in vivo como por ejemplo toxicidad en 2 generaciones en mamíferos, reproducción/crecimiento en anfibios, 2 generaciones en aves, 2 generaciones en peces y 2 generaciones en misidáceos.

Ensayo de reproducción a corto plazo en peces

Materiales y métodos

La prueba requiere tres concentraciones y controles de prueba.

Dos recipientes por tratamiento para pez cebra (cada recipiente con 5 machos y 5 hembras).

Cuatro recipientes por tratamiento para carpita cabezona (cada recipiente con 2 machos 4 hembras dado el comportamiento territorial de la carpita cabezona macho).

Cuatro recipientes o réplicas por tratamiento para medaka japonés (cada recipiente con 3 machos y 3 hembras).

Se evalúan los siguientes parámetros:

Química analítica: recolección de muestras de agua semanales de los tanques para analizar los niveles del químico de prueba.

Vitelogenina (Vg): se usan métodos ELISA para determinar la cantidad de esta proteína precursora de la yema del huevo. La Vg normalmente solo se expresa en peces hembra y está inactiva en los machos. Sin embargo, cuando los peces machos son expuestos a disruptores endocrinos, el gen Vg se expresa de conformidad a la dosis. Por lo tanto, la expresión del gen Vg en peces macho se ha usado como marcador de exposición a disruptores endocrinos estrogénicos.

Observaciones morfológicas: la aparición y observación de características sexuales secundarias como: coloración y panículo adiposo en machos (presencia y peso al terminar), mapeo de tubérculos nupciales, evaluación diaria de supervivencia y comportamiento en comparación con los controles.

Se evalúa el éxito de fertilización, los embriones se evalúan visualmente, se cuentan los huevos fértiles e infértiles.

Fecundidad: se evalúa la producción diaria de huevos.

Supervivencia, comportamiento y apariencia: se observan los peces a diario para registrar la mortalidad y comportamiento anormal en relación con los controles.

Observación de características sexuales secundarias: también se observan características sexuales secundarias especializadas como tubérculos nupciales en la carpita cabezona macho y procesos papilares en el medaka japonés.

Figura 1. Imagen que muestra tubérculos nupciales en la carpita cabezona macho. Usando una plantilla de ubicación, la cantidad y el tamaño de los tubérculos se registran y clasifican como: 0 - ausentes, 1 - presentes, 2 - agrandados y 3 - pronunciados.

Imagen reproducida de OCDE (2012), Test No. 229: Fish Short Term Reproduction Assay, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2, OECD Publishing, París. https://doi.org/10,18/9789264185265-en.

Preparación para histología

Recorte/procesamiento de tejidos

Carpitas cabezonas: se diseccionan las gónadas de los peces y se procesan enteras con cera de parafina.

Medakas japoneses y peces cebra: el cadáver del pez se recorta si es necesario y el torso se procesa entero con cera de parafina.

Incrustación: las gónadas/peces se orientan horizontalmente sujetos por sus ejes largos.

Microtomía: se toman tres secciones a través del centro de las gónadas y se tiñen con hematoxilina y eosina.

Histopatología

Los criterios de diagnóstico principales para los machos incluyen:
Mayor proporción de espermatogonias
Presencia de testis-ova

Mayor degeneración testicular

Hiperplasia/hipertrofia de células intersticiales (Leydig)

Los criterios de diagnóstico secundarios para los machos incluyen:

Menor proporción de espermatogonias

Aumento en el fluido proteináceo vascular o intersticial

Desarrollo asíncrono de las gónadas

Proporciones alteradas de espermatocitos o espermátidas

Disposición gonadal

Inflamación granulomatosa

Figura 1. Gónada de carpita cabezona macho, x20 de aumento. Bar = 50 µm.


Gónada de carpita cabezona macho, x40 de aumento.

Figura 2. Gónada de carpita cabezona macho, x40 de aumento. Bar = 20 µm. Todos los estadios de desarrollo de esperma ordenados alrededor de lóbulos: (1) 1˚ espermatogonias; (2) 2˚ espermatogonias; (3) 1˚ espermatocitos ; (4) 2˚ espermatocitos ; (5) espermatozoas.

Histopatología

Los criterios de diagnóstico principales para las hembras incluyen:

Mayor atresia de ovocitos

Hiperplasia/hipertrofia de células parafoliculares

Menor formación de yema

Cambio en disposición gonadal

Los criterios de diagnóstico secundarios para las hembras incluyen:

Fibrosis intersticial

Restos de huevo en el oviducto

Inflamación granulomatosa

Menor cantidad de folículos posovulatorios

Gónada de carpita cabezona hembra, x4 de aumento.

Figura 3. Gónada de carpita cabezona hembra, x4 de aumento. Bar = 200 µm. Estadios de desarrollo de ovocitos en ambas imágenes: (1) ovocitos perinucleares; (2) ovocitos alveolares corticales; (3) ovocitos vitelogénicos tempranos; (4) ovocitos vitelogénicos tardíos.


Gónada de carpita cabezona hembra, x40 de aumento.

Figura 4. Gónada de carpita cabezona hembra, x40 de aumento. Bar = 20 µm.

Resultados

El ensayo de reproducción a corto plazo en peces es una prueba de cribaje cuyo objetivo es dar una indicación de posible actividad endocrina; no se hace para confirmar ningún mecanismo, modo de acción ni efecto adverso específico. Por lo tanto, cualquier efecto estadísticamente significativo en uno o más parámetros del ensayo podría indicar la posibilidad de que el material de prueba altere el eje HHG de los peces.

Referencias

OCDE (2018), Revised Guidance Document 150 on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption, OECD Series on Testing and Assessment, OECD Publishing, París. https://doi.org/10,18/9789264304741-en

OCDE (2012), Test No. 229: Fish Short Term Reproduction Assay, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2, OECD Publishing, París. https://doi.org/10,18/9789264185265-en.

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