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OECD 231: Programa de evaluación de disruptores endocrinos, ensayo de metamorfosis en anfibios

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Los disruptores endocrinos sustancias o mezclas exógenas que alteran la(s) función(es) del sistema endocrino y, en consecuencia, causan efectos adversos para la salud en un organismo intacto, o su progenie, o (sub)poblaciones.

AUTOR:

Sarah Broadley, BSc (Hons), MSc, PGCE, Científica de Investigación IV, Servicios de Patología Especializada; Dra. Catherine Ross, DVM, MSc, MRCVS, Patóloga, Departamento de Patología de Covance Laboratories Ltd., Harrogate, RU

FECHA:

Enero de 2021

Introducción

"Los disruptores endocrinos son sustancias o mezclas exógenas que alteran la(s) función(es) del sistema endocrino y, en consecuencia, causan efectos adversos para la salud en un organismo intacto, o su progenie, o (sub)poblaciones". CISP-OMS, 2002.

Dada la preocupación de que los químicos ambientales pudieran causar efectos adversos en humanos y la naturaleza, la OCDE inició una actividad de alta prioridad para revisar y desarrollar pautas para evaluar y probar posibles disruptores endocrinos. Las pruebas incluyen una mejora de la prueba de dosis repetidas de 28 días en roedores (pauta de prueba 407) y el ensayo de metamorfosis en anfibios (pauta de prueba de AMA 231).

"Los disruptores endocrinos son sustancias o mezclas exógenas que alteran la(s) función(es) del sistema endocrino y, en consecuencia, causan efectos adversos para la salud en un organismo intacto, o su progenie, o (sub)poblaciones". CISP-OMS, 2002.

Dada la preocupación de que los químicos ambientales pudieran causar efectos adversos en humanos y la naturaleza, la OCDE inició una actividad de alta prioridad para revisar y desarrollar pautas para evaluar y probar posibles disruptores endocrinos. Las pruebas incluyen una mejora de la prueba de dosis repetidas de 28 días en roedores (pauta de prueba 407) y el ensayo de metamorfosis en anfibios (pauta de prueba de AMA 231).

Reglamentaciones

En 2018, la OCDE publicó un marco conceptual revisado de pautas para hacer pruebas y evaluar la disrupción endocrina de químicos. El marco conceptual está integrado por cinco niveles de pruebas y está diseñado para usarse como conjunto de herramientas.

Nivel 1: ordenar y priorizar basado en la información existente.

Nivel 2: ensayos in vitro para generar datos mecanísticos.

Nivel 3: ensayos in vivo para generar datos sobre los mecanismos endocrinos seleccionados y efectos.

Nivel 4: ensayos in vivo para generar datos sobre efectos adversos en mecanismos endocrinos.

Nivel 5: ensayos in vivo para generar datos integrales sobre efectos de los mecanismos endocrinos y otros mecanismos.

El ensayo de metamorfosis en anfibios entra en el Nivel 3 junto con el ensayo de reproducción a corto plazo en peces, el ensayo uterotrópico y el ensayo de Hershberger.

Actualmente, en la UE no existe ningún requisito reglamentario de usar pruebas específicas para disrupción endocrina a menos que se solicite hacerlas.

En EE. UU., no obstante, las pruebas son obligatorias y la EPA de EE. UU. ha desarrollado una estrategia de dos niveles.

Ensayos de nivel 1: una selección de ensayos in vitro e in vivo. El ensayo de metamorfosis en anfibios y el ensayo de reproducción a corto plazo en peces entran dentro de esta variedad de pruebas.

Ensayos de nivel 2: ensayos atípicos in vivo como por ejemplo toxicidad en 2 generaciones en mamíferos, reproducción/crecimiento en anfibios, 2 generaciones en aves, 2 generaciones en peces y 2 generaciones en misidáceos.

Ensayo de metamorfosis en anfibios

Materiales y métodos

El ensayo de metamorfosis en anfibios (AMA) es un ensayo de cribaje para identificar empíricamente sustancias que pudieran llegar a interferir con el funcionamiento normal del eje hipotalámico-hipofisario-tiroideo (HHT). Ofrece un proceso bien estudiado que depende de la tiroides y que responde a sustancias activas dentro del eje HHT, y es el único ensayo existente que detecta actividad de la tiroides en un animal que se encuentra en desarrollo morfológico.

El diseño de la prueba implica exponer renacuajos de Xenopus laevis en etapa 51 a un mínimo de tres concentraciones diferentes de un químico de prueba y control de agua por 21 días. La densidad larval es de 20 renacuajos por tanque de prueba.

Mediciones al día 7

Se eligen cinco renacuajos al azar y se les practica la eutanasia con un trato digno. Se enjuagan, secan y se determina su peso corporal. Se determina el largo de las extremidades posteriores, la longitud hocico-respiradero y la etapa de desarrollo para cada renacuajo.

Mediciones al día 21

Se sacan los renacuajos restantes del tanque de prueba y se les practica la eutanasia con un trato digno. Se enjuagan, secan y se determina su peso corporal. Se determina el largo de las extremidades posteriores, la longitud hocico-respiradero y la etapa de desarrollo para cada renacuajo.

Los renacuajos se colocan en fijador de Davidson por 48 a 72 horas ya sea como muestras enteras o muestras con la cabeza cortada incluyendo la quijada inferior.

Se evalúa la histopatología de cinco renacuajos por tanque.

Preparación para histología

Recorte de tejidos: se procesa la cabeza entera con cera de parafina.

Incrustación: la cabeza se incrusta ya sea de ventral a dorsal sobre un plano horizontal [presentación longitudinal (LS)] o con el sitio de sección orientado hacia abajo [presentación transversal (TS)].

Microtomía: se toman cinco secciones a través de la tiroides y se tiñen con hematoxilina y eosina.

Histopatología

Los criterios de diagnóstico incluyen: hipertrofia/atrofia de la glándula tiroides, hipertrofia de células foliculares, hiperplasia de células foliculares

Calidad de coloide/área de lumen folicular y altura/forma de células foliculares

Imagen 1. Glándulas tiroides (flechas), sección longitudinal, x2 de aumento.


Imagen 2. Glándulas tiroides (flechas). x10 de aumento. Bar = 50 µm.


Imagen 3. Glándulas tiroides (flechas), sección transversal, x2 de aumento.


Imagen 4. Glándulas tiroides (flechas), sección transversal, x10 de aumento. Bar = 100 µm.

Resultados

Se han demostrado efectos en la histología de la glándula tiroides con ausencia de efectos en el desarrollo. En el caso de ver cambios histopatológicos en la tiroides, se considera activo. Si no se ve ningún retraso en el desarrollo ni cambios histopatológicos, el químico se considera como inactivo en la tiroides. Esto es porque la glándula tiroides está bajo la influencia de la hormona estimulante de la tiroides (TSH) y cualquier químico que altere la hormona tiroidea circulante lo suficiente como para alterar la secreción de TSH generará cambios histopatológicos en las glándulas tiroideas.

Referencias

OCDE (2018), Revised Guidance Document 150 on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption, OECD Series on Testing and Assessment, OECD Publishing, París. https://doi.org/10,18/9789264304741-en

OCDE (2009), Test No. 231: Amphibian Metamorphosis Assay, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2, OECD Publishing, París, https://doi.org/10,18/9789264076242-en.

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